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您的位置:首頁>>生命科學>>CRISPR系列>>HA11509/32104 AsCas12a(cpf1) Crispr 核酸酶
Cat. Number
HA11509/32104
Chemical Name
HA11509/32104 AsCas12a(cpf1) Crispr 核酸酶
CAS Number
HA11509/32104
Qty 1
100pmol
Qty 2
1000pmol
Storage condition
組分-20℃儲存;≤ 0℃運輸。
References

AsCas12a(又名AsCpf1)一種由crRNA單獨引導的DNA核酸內切酶,來源于Acidaminococcus sp. BV3L6菌株。在靶標雙鏈DNA存在PAM (TTTV,V=A/C/G)序列的情況下,AsCas12a可特異地剪切靶標雙鏈DNA,使DNA雙鏈斷裂并生成粘性末端。而AsCas12a特異地剪切單鏈DNA靶標不依賴PAM序列。此外,雙鏈或單鏈DNA靶標均能激活AsCas12a的反式剪切活性(即旁路剪切活性/附屬剪切活性),即當AsCas12a酶與crRNA、靶標DNA結合形成三元復合物后,便會被激活針對非特異序列ssDNA的反式剪切活性,將體系中的任意序列ssDNA切碎。因此,AsCas12a酶不僅可用于體外dsDNA的特異剪切,也可用于靶標核酸的快速檢測,詳見本公司開發的HOLMES[1]核酸快檢技術。

產品優勢

? 標準化定義的反式剪切活性:在總體積為20 μL的1 × HOLMES Buffer 1 [pH 8.5]反應體系中,37℃反應條件下,1 min內剪切1 pmol ssDNA探針所需的Cas12a酶量定義為1 transU。本公司提供的Cas酶transU數值可于COA檢測報告中查詢。 

產品組分

組分32104-01(100pmol)32104-03(1,000pmol)
AsCas12a Nuclease (10 μM) a100 pmol1,000 pmol
10 × HOLMES Buffer 11 mL1 mL

a.FnCas12a Nuclease濃度為10 μM,即10 pmol/μL,100 pmol規格的總體積為10 μL,1,000 pmol規格的總體積為100 μL;


實驗案例

1.AsCas12a的順式剪切:本實驗中使用小鼠來源的DNMT1基因的部分片段作為靶標,靶標雙鏈DNA總長度為825 bp,實驗中設計的crRNA包含與DNMT1序列互補的spacer區。實驗結果表明,AsCas12a在crRNA的引導下特異識別并剪切DNMT1序列,導致靶標DNA雙鏈斷裂,得到2段順式剪切產物,片段大小分別為525 bp和300 bp。

圖1:AsCas12a的順式剪切活性

2.AsCas12a的反式剪切:本實驗中使用小鼠來源的DNMT1基因的部分片段作為靶標dsDNA,實驗中設計的crRNA包含與DNMT1序列互補的spacer區。同時,在剪切反應體系中加入ssDNA報告探針,該探針5′端標記熒光報告基團(FAM),3′端標記熒光淬滅基團(BHQ1)。實驗結果表明,當AsCas12a在crRNA引導下與特異靶標dsDNA形成三元復合物后,便會被激活針對ssDNA的高效反式剪切活性,將體系中的ssDNA報告探針切碎,從而發出熒光信號。

圖2:AsCas12a的反式剪切活性

 

實驗流程

  1. 順式剪切實驗


    組分體積終濃度
    10 × HOLMES Buffer 1
    2 μL
    1 ×
    10 μM AsCas12a Nuclease
    0.5 μL
    250 nM
    10 μM crRNA
    0.5 μL
    250 nM
    1 μM Target DNA
    0.5 μL
    25 nM
    Nuclease-free water
    Up to 20 μL

◆ 順式剪切體系中Target DNA可為ssDNA或帶PAM序列的dsDNA。

◆ 若用核酸電泳來分析順式剪切產物,建議使用dsDNA靶標,因為ssDNA靶標會被反式激活的Cas12a進一步切碎。對于20 μL順式剪切應體系,推薦target DNA的使用量為100 ng~500 ng,且target DNA片段長度在300 bp~3 kb范圍內。不同長度target DNA需要的Cas酶和crRNA的量需要根據target DNA的摩爾量計算,建議保持Cas酶:crRNA:target DNA的摩爾比為10:10:1,以盡量確保target DNA被剪切完全。

◆ 37℃反應30 min~1 h,85℃滅活5 min,核酸電泳分析順式剪切產物。

 

2. 反式剪切實驗

組分體積終濃度
10 × HOLMES Buffer 12 μL1 ×
10 μM AsCas12a Nuclease0.05~0.5 μL25~250 nM
10 μM crRNA0.05~0.5 μL25~250 nM
1 μM Target DNA0.5~5 μL25~250 nM
10 μM ssDNA Reporter0.05~0.5 μL25~250 nM
Nuclease-free waterUp to 20 μL

◆ 反式剪切體系中Target DNA可為ssDNA或帶PAM序列的dsDNA。

◆ 反式剪切體系中各組分的用量可以根據不同的實驗目的進行調整,用量較少時可先將各組分稀釋后加入體系,FnCas12a Nuclease可用1×HOLMES Buffer 1稀釋,稀釋后需立即使用(若要稀釋后的Cas12酶長期保存,請使用Cas12 Dilution Buffer,#32012),crRNA、Target DNA及ssDNA Reporter可用Nuclease-free Water稀釋,但極低濃度的Target DNA(例如LOD實驗)建議用0.1% Tween 20稀釋并使用低吸附的離心管、吸頭等耗材。

◆ 反式剪切體系中探針的用量和預期反應到達平臺期的時間可參考各批號Cas酶transU的具體數值,詳見本公司提供的COA檢測報告!

◆ 實時熒光定量PCR儀檢測熒光信號,37℃反應,每30 sec采集一次熒光信號。



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貨號名稱規格
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GMP-041重組人腫瘤壞死因子(rhTNF-a)50ug/1.0mg
GMP-042重組人轉化生長因子(rhTGFβ1)50ug/1.0mg
GMP-043重組人血管內皮生長因子(rhVEGF)50ug/1.0mg
GMP-044重組人Wnt-3α(rhWnt-3α)50ug/1.0mg
GMP-045重組人胰島素(rhInsulin)1.0g/10.0g
GMP-046牛轉鐵蛋白(Bovine Transferrin) inactivated virus1.0g/10.0g
GMP-047重組人干擾素α2b1.0mg
GMP-048重組人粒細胞集落刺激因子1.0mg
E-001重組CRISPR-Cas9蛋白100/500pmol
E-002重組CRISPR-Cas12a蛋白100/2000pmol
E-003重組CRISPR-Cas13a蛋白100/500pmol
E-004重組SUMO蛋白酶1000U
E-005重組TEV蛋白酶1000/10000U
E-006Spike Protein (RBD, mouseFc Tag)1mg/10mg
E-007Spike Protein (S1 Subunit, His Tag)1mg/10mg
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VISC2-RB05RBD-591蛋白(RBD-591 Subunit,His Tag)100ug/1.0mg


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